Maxamovo–Gilbertovo sekvenování

Technology

12 hours ago

Author

Maxamovo-Gilbertovo sekvenování je metoda sekvenování DNA vyvinutá Allanem Maxamem a Walterem Gilbertem v letech 1976-1977. Tato metoda je založena na modifikaci DNA pro jednotlivé nukleové báze a následném štěpení DNA v místech přiléhajících k modifikovaným bázím. Příklad Maxamova-Gilbertova sekvenování. Štěpí se stejně označené fragmenty DNA na různých místech což utváří označené fragmenty různých velikostí. Fragmenty pak mohou být odděleny pomocí gelové elektroforézy. Maxamovo-Gilbertovo sekvenování byla první široce přijatou metodu pro sekvenování DNA, a spolu se Sangerovou metodou, představuje metodu první generace sekvenování DNA. Maxamovo-Gilbertovo sekvenování se již v širokém měřítku nepoužívá, bylo totiž nahrazeno metodami 2. a 3. generace.

Historie

I přesto, že Maxam a Gilbert zveřejnili svá pozorování dva roky poté, co Frederick Sanger a Alan Coulson publikovali své práce na „plus-minus“ sekvenování, Maxamovo-Gilbertovo sekvenování se rychle stalo populární, protože čtená DNA může být použita přímo, zatímco původní Sangerova metoda vyžaduje, aby každé čtení bylo provázeno tvořením kopií čteného fragmentu. S rozvojem moderních sekvenačních metod (454 sekvenování, Illumina), popularita Maxamova-Gilbertova sekvenování klesla a vzhledem k jeho technické složitosti a rozsáhlému používání nebezpečných chemických látek, je jeho použití v standardních molekulárně-biologických soupravách vyloučeno.

Postup

Maxamovo-Gilbertovo sekvenování vyžaduje radioaktivní značení na 5' konci DNA čteného fragmentu (typicky prostřednictvím gama-32P ATP). Chemické reakce „rozlamují“ čtený úsek na jedné nebo dvou ze čtyř nukleotidových bází v každé ze čtyř reakcí (A+G ,G, C, C+T). +more Například puriny (A+G) jsou „rozlamovány“ pomocí kyseliny mravenčí, guaniny (a do jisté míry adeniny) jsou methylovány dimethylsulfátem a pyrimidiny (C+T) jsou hydrolyzovány pomocí hydrazinu. Přidání soli (chlorid sodný) k reakci hydrazinu inhibuje reakce thyminu pouze na rozpad cytosinu.

Fragmenty vznikající ve čtyřech reakcích jsou za působení elektroforézy odděleny podle délky s pomocí gelové elektroforézy. Pro zobrazení fragmentů seřazených podle délky je použita autoradiografie, která zaznamenává radioaktivní záření 32P.