Spektrální průtoková cytometrie

Spektrální průtoková cytometrie (spectral flow cytometry) je technikou založenou na konvenční průtokové cytometrii, kde spektrograf a vícekanálové detektory (obvykle CCD) nahrazují tradiční zrcadla, optické filtry a fotonásobící trubice (PMT). Průtoková cytometrie umožňuje rychlý sběr a analýzu víceparametrových dat na jednotlivých buňkách nebo částicích. Moderní spektrální průtoková cytometrie představuje několik možností nastavení přístrojů a analýzy dat, jejichž výběr je nakonec určen potřebami biologických aplikací. Rychlost analýzy, citlivost a spektrální rozlišení jsou často konkurenčními úvahami, které musí být vyváženy s ohledem na potřeby biologické aplikace. Pokud jde o konvenční průtokovou cytometrii, měření vysokou rychlostí znamená kratší časy měření se sníženým časem osvětlení a nekvalitním rozlišením. Při spektrální průtokové cytometrii vede vyšší rozlišení k tomu, že stejné množství světla je distribuováno na více detekčních prvků, což vede k menšímu počtu fotonů na jedno měření.

Systém s disperzním optickým systémem poskytuje jednodušší nastavení a zároveň nabízí možnost použití většího počtu parametrů měření. Konvenční systémy byly vyvinuty tak, aby nabízely vyšší počet současně měřitelných parametrů: systémy až s 19 parametry, přímý rozptyl, boční rozptyl a více fluorescenčních kanálů, ale vyžaduje to více PMT, filtru, laserů, vícenásobné fluorochromové štítky a selektivní zrcadla vlnové délky. +more Problém, který vzniká při pokusu o rozšíření těchto systémů na více kanálů, je kromě nákladů a provozních výzev, obecně fluorescenční charakteristiky fluoroforů. S použitím více fluorescenčných fluoroforů dochází k více překryvům a je obtížné rozlišit jednotlivé signály na různých kanálech parametrů. Použití spektrografu se spektrálními dekonvolučními algoritmy má potenciál pro komplexnější a flexibilnější přístup k vícebarevným nebo multiparametrickým analýzám.

Klíčové technologické vývoje přidaly nový impuls k vývoji spektrální průtokové cytometrie (SFC). Jedním z nich je dostupnost fluorescenčních nanokrystalů s jejich charakteristickými širokými absorpčními pásmy a relativně úzkými emisními pásmy a vývoj detektorů elektronového násobení CCD s mnohem vyšší citlivostí. +more Cílem systémů SFC je poskytovat vysokorychlostní analýzy a nakonec možnost třídění buněk. V současné době je míra analýz pro spektrální průtokové systémy poměrně pomalá, což bude jednou z klíčových výzev v rozvoji této technologie.

Historie

Zájem o měření úplných fluorescenčních spekter buněk v průtokové cytometrii lze vysledovat až do počátečních dnů průtokové cytometrie, s mnoha pozoruhodnými snahami o vývoj nástrojů, které používají nejmodernější detektory, elektroniku a software. Obecně platí, že tyto počáteční snahy používaly disperzní optiku, jako jsou hranoly, aby rozptýlily světlo na detektorové pole, což bylo často omezujícím faktorem výkonu. +more Nejstarší zmínky o cytometrii použili přístup k měření průměrných spekter mnoha částic, zatímco pozdější detektory umožnily měření spekter jednotlivých částic. Alternativní přístupy zahrnovaly použití skenovacího monochromátora a fotonásobící trubice pro postupné měření při různých vlnových délkách, které umožnily měření průměrných populačních spekter s relativně vysokým rozlišením. Kompromisy mezi rychlostí, citlivostí a spektrálním rozlišením omezily dopad těchto časných systémů, avšak v posledních letech zlepšování optiky, detektorů a datových systémů umožnilo vývoj spektrálních průtokových cytometrů, které mohou rutinně provádět rychlé a citlivé měření s vysokým rozlišením buněk a jiných částic.

Princip

Hydrodynamický tok tekutiny se používá jako plášť, který je zaměřen na tok s užším průměrem, který vede k oddělení buněk. Laser se používá k excitaci spektroskopicky aktivních míst buněk. +more Obvykle se měří dva parametry rozptylu: 1) rozptyl dopředného směru od zdroje laseru (forward scatter) a 2) rozptyl bočních ploch (side scatter). Spolu s nimi jsou detekované spektroskopické signály, které jsou obvykle fluorescenční signály z různých fluorochromů; tyto signály jsou odebírány v bočním kanálu obvykle 90° směrem ke směru excitačního laseru.

V konvenčním průtokovém cytometru jsou fluorescenční signály odděleny do zvláštních pásem za použití řady filtrů a dichroických zrcadel a každý jednotlivý kanál je měřen pomocí PMT. Avšak v spektrálním průtokovém cytometru se rozptýlené boční světlo včetně fluorescence shromažďuje a spojí do spektrografu - buď přímo nebo prostřednictvím optického vlákna - kde je celý světelný signál rozptýlen a zobrazen jako spektrum s vysokým rozlišením na CCD nebo vícekanálovém detektoru.

Design experimentu a analýza dat

Kromě obecných úvah o návrhu a provedení konvenčních experimentů s průtokovou cytometrií, včetně titračních činidel a včetně vhodných kalibračních a kontrolních vzorků, zahrnuje spektrální průtoková cytometrie několik dalších úvah včetně spektrální kalibrace. Zatímco většina principů analýzy dat pro konvenční průtokovou cytometrii je relevantní, analýza spektrálních dat poskytuje další výzvy a příležitosti pro extrakci vzorků biologické informační formy.

Spektrální kalibrace

Obrazové spektrografy propojené s detektory, jako jsou CCD, jsou obecně kalibrovány pomocí nízkotlakých rtuťových, argonových a xenonových výbojek s charakteristickými a dobře charakterizovanými spektry. Získají se spektra, přidělují se „peaky“ (vrcholy) a je naměřen graf pixelů v závislosti na vlnové délce pro interpolaci spektrálního rozsahu detektoru.

Aplikace v biologii

Vývoj biologických aplikací spektrální průtokové cytometrie je stále v počáteční fázi, přičemž většina dosud publikovaných prací je ve formě demonstračních nebo validačních studií. Důležitou první zkouškou pro přístroj je tedy analýza referenčních nebo kalibračních kuliček. +more Například polymerní mikrosféry impregnované různými fluorochromy byly použity k prokázání fluorescenční detekce na časné generaci spektrometrického průtokového cytometru s vysokým rozlišením. Značky pro zachycení protilátek jsou také široce používány v konvenční průtokové cytometrii pro kalibraci a jako kompenzační referenční standardy a tyto byly použity podobným způsobem pro spektrální průtokovou cytometrii. Imunofluorescenční detekce je pravděpodobně největší třídou aplikací průtokové cytometrie a bylo prokázáno použití spektrální průtokové cytometrie pro imunofluorescenci mononukleárních buněk periferní krve (PBMCs) s použitím vysokorychlostního spektrometrického průtokového cytometru na bázi PMT, stejně jako systém s pomalejší rychlostí a vysokým rozlišením .

Reference

Kategorie:Průtoková cytometrie Kategorie:Cytologie