Gramovo barvení

Technology

12 hours ago

Author

mozkomíšním moku Gramovo barvení je jednoduchá metoda barvení o několika krocích, která ve svém výsledku rozliší bakterie na dvě velké skupiny lišící se v uspořádání buněčné stěny: grampozitivní a gramnegativní bakterie. Tuto techniku vyvinul roku 1884 dánský vědec Hans Christian Gram, aby s její pomocí snadno rozeznal pneumokoky od Klebsiela pneumoniae. Jde o naprosto nejzákladnější metodu barvení v bakteriologii.

Gramovo barvení se ale nepoužívá pro klasifikaci archeí, dříve archaeabacterií, protože tyto mikroorganismy reagují na toto barvení velmi různorodě, navíc bez ohledu na své fylogenetické skupiny.

Stručný popis základních kroků

# fixace vzorku # primární barvení krystalovou violetí (vše je nyní modrofialové) # fixace obarvení Lugolovým jodovým roztokem (vše stále modrofialové) # odbarvení acetonem nebo etanolem (grampozitivní modrofialové, gramnegativní odbarvené) # barvení safraninovým roztokem (grampozitivní stále modrofialové, gramnegativní nyní růžové)

Podrobnější postup

Příprava preparátu

Stěr se nanáší na dobře odmaštěné podložní sklíčko a vysuší se suchým vzduchem. Fixaci lze provést až po úplném vyschnutí vzorku.

Fixace

Cílem fixace je kromě stabilizace preparátu i usmrcení buněk, neboť barvení mrtvých buněk dává lepší výsledek. Fixaci lze provést mechanickou či chemickou cestou - při mechanické fixaci se stěr fixuje dvojím či trojím protažením nad horní částí svítivého plamene hořáku, celková doba ohřevu nesmí přesáhnout dobu 2 sekund. +more Fixace se prověří přiložením preparátu k zápěstí - podložní sklíčko musí být horké, nikoliv žhavé (70-80 °C). Při chemické fixaci se preparát ponoří na 10-15 minut do nádoby s fixativem (metylalkoholem, acetonem, nebo Nikiforovým činidlem) a po fixaci se usuší na vzduchu.

Barvení G+

# Na fixovaný preparát se přes filtrační papír nalije základní trifenylmetanové barvivo (genciánová, metylová nebo krystalická violeť) a nechá se působit 2-3 minuty # Základní barvivo se slije a preparát se ponoří do Lugolova, případně Gramova činidla (vodný roztok jodidu draselného a krystalického jódu 2:1) až do zčernání vzorku - cca 1 až 2 minuty # Preparát se promývá roztokem 96% etylalkoholu či metyalkoholu do plného odbarvení G− (několik desítek sekund, promývající kapalina musí být bezbarvá)

Barvení G−

# Preparát se vymyje destilovanou vodou po dobu 2 minut # Obarvení G− skupiny se provede fuchsinem nebo safraninem po dobu 3-5 minut. # Preparát se promyje destilovanou (v nouzi pouze běžnou tekoucí) vodou a vysuší filtračním papírem.