Cesko.wiki ELISA
Author
Albert FloresELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci a stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek. Principem této metody je imunoenzymatické reakce bezbarvého (chromogenního) substrátu, který je hydrolyzován v barevný produkt a lze měřit spektrofotometricky. Intenzita zabarvení koreluje s koncentrací detekovaného antigenu nebo protilátky. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost vázat se na povrch plastů (např. polystyrenu) a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty (viz protilátka) imunoglobulinových molekul.
Základní složky ELISA testu
Klasická 96-jamková destička pro metodu ELISA
# Antigen #* detekovaný v testovaném vzorku #* známý, komerčně připravovaný # Protilátka #* detekovaná v testovaném séru #* známá, komerčně připravovaná # Konjugát #* jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (proti IgG, IgM, IgA, viz protilátka), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) # Substrát #* je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu
Pro imunoenzymatickou reakci jsou používány různé typy enzymů a substrátů (enzym/substrát):
Alkalická fosfatáza (AP) / paranitrofenyl fosfát (PNPP), žlutý produkt rozpustný ve vodě, absorbuje světlo o vlnové délce 405 nm
Křenová peroxidáza (HRP) / 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6- kyselina sulfonová]-diammoniová sůl (ABTS) zelený produkt, absorbuje světlo o vlnové délce 410 a 650 nm, ortho-fenyldiamin dihydrochloride (OPD) ve vodě rozpustný žluto-oranžový produkt, vlnová délka 492 nm, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) modrý produkt, po přidání kyseliny sírové nebo fosforečné přeměna na žlutý produkt, absorbance 450 nm.
Beta galaktosidáza (β-Gal) / o-nitrofenol-β-D-galactopyranosid (ONPG), Naftol-AS-Bl-beta-D-galactopyranosid (Nap-Gal), and 4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-galactopyranosid (MUm-Gal), chlorfenolová červeň β-D-galactopyranosid (CPRG)
Způsoby detekce antigenu
Používají se tyto čtyři detekce:
* Přímá ELISA
Primární protilátky jsou přímo konjugované s enzymem.
* Nepřímá ELISA
# Primární protilátky jsou konjugované s biotinem (následuje přidání streptavidinu konjugovaného s enzymem) # Na antigen se vážou neznačené primární protilátky, na které se následně vážou sekundární protilátky konjugované s enzymem nebo biotinem
* Sendvičová ELISA
Dno jamky 96-jamkové destičky je potažené protilátkami, které vážou antigen. Na antigen se vážou i detekční protilátky. Může se jednat o ELISA přímou i nepřímou.
* Kompetitivní ELISA
Primární protilátka je inkubována s antigenem. V reakci vznikají komplexy antigenu s protilátkou. +more Čím více antigenu je ve vzorku, tím méně volných protilátek zůstane. Tato suspenze je poté přidány do jamky s imobilizovaným antigenem. Volné primární protilátky se vážou na imobilizovaný antigen a jsou detekovány enzymaticky značenými sekundárními protilátkami. Nakonec je přidán chromogenní substrát. Koncentrace antigenu je nepřímo úměrná intenzitě signálu.
Praktické použití
Metody ELISA se využívají k diagnostice infekčních nemocí člověka a zvířat. Stanovují se buď protilátky proti konkrétnímu patogenu nebo se detekují přímo prionové, virové, bakteriální, parazitární antigeny. +more Antigen lze detekovat v séru, tkáních a tkáňových tekutinách (např. mozkomíšní mok), trusu (stolici) a slinách atd. Detekce patogenů v trusu se označuje jako koproantigen ELISA. Dále se ELISA používá k detekci některých toxinů, hormonů, celé řady proteinů, případně dalších bioaktivních látek. Vědci pracují i na vývoji metod ELISA pro kosmický výzkum, například k detekci forem života na Marsu.
Modifikace ELISA testu
FLISA * RIA
Reference
Literatura
Toman M. a kol. +more: Veterinární imunologie. Grada Publishing, Praha, 2000. * Tijssen P. : Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Elsevier, Amsterdam, 1985. * Tizard, I. R. : Veterinary Immunology - an introduction. Saunders co. , Philadelphia, 1996.