Cesko.wiki Fluorescenčně značená protilátka
Author
Albert FloresDetekce molekuly na povrchu buňky pomocí fluorescenčně značené protilátky. Fluorescenčně značené protilátky označují konjugát specifické monoklonální protilátky s fluoroforem. Značené protilátky se hojně využívají například v průtokové cytometrii nebo fluorescenční mikroskopii k diagnostickým nebo zobrazovacím účelům. Poprvé byly fluorescenčně značené protilátky popsány v roce 1942 a využity k detekci antigenních determinant v savčí tkáni.
.|náhled|607x607bod){kind=link}
Fluorofor je navázán na konstantní část protilátky kovalentní vazbou. Tato vazba se může uskutečnit přes amino, thiolovou nebo hydroxylovou skupinu. +more Na jednu molekulu protilátky se při konjugační reakci může navázat vyšší počet molekul fluoroforu. Počet fluorescenčních molekul je ale omezený, neboť větší množství fluoroforů by se mohlo navzájem zhášet a tím snižovat intenzitu fluorescence. Konjugační reakce by v ideálním případě neměla mít vliv na aviditu protilátky. Průměrný počet fluorescenčních molekul navázaných na protilátku je definován jako "stupeň značení" (DOL, z angl. degree of labeling) a může být určen na základě absorpčního spektra značené protilátky.
V současné době existuje velké množství fluorescenčních molekul využívaných k vazbě na monoklonální protilátky. Mezi běžně využívané fluorofory patří například fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE) nebo allophycocyanin (APC). +more Pro rozšíření spektra fluorescenčních markerů a pro použití v mnohobarevných analýzách se také využívají tandemové (z angl. tandem dyes) nebo polymerní (z angl. polymer dyes) barvy. Tandemové barvy využívají přenosu energie (FRET) mezi dvěma kovalentně vázanými fluorofory (donorem a akceptorem). Výsledkem je zvýšení rozdílu mezi excitačním a emisním spektrem (Stokesův posuv) tandemové barvy, jejíž emisní spektrum je tak možné odlišit od emisního spektra donorové molekuly. Hojně využívaná tandemová barva je například PE-Cy7 (phycoerythrin kovaletně vázaný s malou molekulou cyanine 7).
Využití v průtokové cytometrii
Průtoková cytometrie a třídění (sorting) buněk je založené na vazbě fluorescenčně značených protilátek na povrchové nebo intracelulární znaky buněk. Specifická vazba epitopu a protilátky zajistí označení vybraných molekulárních znaků specifickým fluoroforem. +more Na základě rozličné intenzity fluorescence a emisních spekter jednotlivých fluoroforů je pak možné rozlišit a kvantifikovat jednotlivé buněčné populace a případně je třídit.
Využití ve fluorescenční mikroskopii
Ve fluorescenční mikroskopii je využití fluorescenčně značených protilátek označováno jako imunofluorescence. V označení cílové struktury se využívá přímé nebo nepřímé detekce. +more K zobrazení fluorescenčně označených molekulárních struktur se využívá fluorescenční mikroskop, vybavený speciálními lasery k excitaci fluoroforů a odpovídajícími filtry k detekci emisních spekter.
Přímá a nepřímá detekce
Přímá a nepřímá detekce využívá fluorescenčně značených protilátek v rozdílných stádiích značení. Přímá detekce využívá primární protilátku značenou fluorescenční molekulou pro bezprostřední rozpoznání cílové struktury. +more Nepřímá detekce využívá značené protilátky až v druhém kroku po označení cílové struktury první neznačenou protilátkou.
