Cesko.wiki Försterův rezonanční přenos energie
Author
Albert FloresJablonského diagram FRET přenosu mezi donorem a akceptorem Pokles fluorescence CFP (donor) a nárůst fluorescence YFP (akceptor) v důsledku FRET při jejich přibližování Försterův rezonanční přenos energie (FRET) či nesprávně Fluorescenční rezonanční přenos energie je mechanismus nezářivého přenosu energie mezi dvěma molekulami prostřednictvím dipól-dipólové interakce. Molekula, z níž se energie přenáší, se nazývá donor (dárce), kdežto molekula, která energii přijímá, se nazývá akceptor (příjemce).
Účinnost tohoto mechanismu je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem, k jevu tedy prakticky dochází jen tehdy, jsou-li obě molekuly v těsné blízkosti. Z intenzity FRET (kterou lze určit různými metodami analýzy fluorescence vzorku) lze proto získat informaci o míře interakce mezi donorem a akceptorem. +more To je velmi cenné především při studiu živých buněk.
Historie
Jedny z prvních experimentálních důkazu existence FRET získali roku 1922 G. Cairo a J. +more Franck. Pozorovali, že ozařují-li páry rtuti a thallia světlem o vlnové délce spadající do oblasti absorpce rtuti, dochází částečně ke fluorescenci thallia. Tento jev nazvali „senzibilizovaná fluorescence“. Na objasňování principu tohoto jevu se podíleli např. Jean-Baptiste Perrin, Francis Perrin, Hartmut Kallman či Fritz London. Se správným modelem však přišel až v roce 1948 Theodor Förster, po němž je dnes jev pojmenován.
Fyzikální popis
Klasický přístup
Odvození
FRET je čistě elektromagnetickým jevem spočívajícím v nezářivém přenosu energie mezi dvěma dipóly (donorem a akceptorem) na vzdálenost podstatně menší, než je vlnová délka záření emitovaného kmitajícím donorem. K odvození správného vztahu pro FRET lze použít klasický popis. +more Energie Coulombické interakce mezi nabitými tělesy A a B s nábojovou hustotou \rho_A a \rho_B, vzdálenými od sebe r'-r, je.
{{vzorec|V_{AB} = {{1} \over {4\pi\epsilon_0}}{\int\int}{{\rho_A(r')\rho_B(r)}\over
| {r'-r} |
|---|
Provedeme-li multipólový rozvoj uvedeného potenciálu, dostaneme
{{vzorec|V_{AB} = {{1} \over {4\pi\epsilon_0}} {\left [ {{q_A q_B}\over{R}} + {{q_A \boldsymbol\mu_B \cdot \boldsymbol R}\over{R^3}} - {{q_B \boldsymbol\mu_A \cdot \boldsymbol R}\over{R^3}} + {{R^2\boldsymbol\mu_B \cdot \boldsymbol R - 3(\boldsymbol\mu_A \cdot \boldsymbol R)(\boldsymbol\mu_B \cdot \boldsymbol R)}\over{R^5}} \right]}|2}}
kde R = r'-r.
Pro nenabité částice je nenulový pouze poslední ze členů v závorce, který odpovídá dipól-dipólové interakci. Právě tento člen je zodpovědný za existenci FRET, ale také např. +more za van der Waalsovské interakce. Ostatní členy pro jednoduchost zanedbáme, budeme tedy uvažovat, že akceptor je dipól indukovaný polem dipólu donoru.
Intenzitu FRET lze vyjádřit jako
{{vzorec|{\gamma_{D \to A} \over \gamma_{0}} = {P_{D \to A} \over P_{0}}|3}}
kde poměr rychlostní konstanty přenosu energie z donoru na akceptor \gamma_{D \to A} a rychlostní konstanty deexcitace donoru prostřednictvím jiných mechanismů \gamma_{0} (obě uvedené rychlostní konstanty mají hodnotu převrácených hodnoty příslušných dob života) je vyjádřen jako podíl energie absorbované akceptorem za jednotku času P_{D \to A} a energie vyzářené za jednotku času donorem v nepřítomnosti akceptoru P_{0}. Hodnotu P_{0} lze určit pomocí vztahu pro energii vyzařovanou dipólem kmitajícím s frekvencí \omega_0:
{{vzorec|P_0 = {{|\mu_D|^2\ n(\omega_0)} \over {12 \pi \epsilon_0 c^3}}\omega_0^4|4}}
Veličinu P_{D \to A} na základě Poyntingoy věty vyjádříme jako
{{vzorec| P_{D \to A} = {-{1 \over 2}} \int\limits_{V_A} {Re\{ {\boldsymbol{j^*_A}} \cdot {\boldsymbol{E_D}} \}} \,dV|5}}
kde E_D je elektrické pole generované donorem a j_A je proudová hustota asociovaná s přítomností akceptorového dipólu. Tu lze vyjádřit jako
čímž se zjednoduší na
{{vzorec| P_{D \to A} = {\omega_0 \over 2} Im\{\boldsymbol \mu^*_A \cdot \boldsymbol E_D(\boldsymbol r_A) \} |7}}
Jelikož \mu_A je dipól indukovaný polem donoru, můžeme ho vyjádřit prostřednictvím tenzoru polarizovatelnosti akceptoru \alpha_A:
Za předpokladu, že akceptor lze polarizovat pouze ve směru vektoru jeho dipólového momentu \boldsymbol \mu_A (tedy že lze psát \boldsymbol \mu_A = \alpha_A \boldsymbol n_A \boldsymbol n_A), rovnice přejde na
{{vzorec| P_{D \to A} = {\omega_0 \over 2}\ Im\{\boldsymbol \alpha_A \}\ |\boldsymbol n_A \cdot \boldsymbol E_D(\boldsymbol r_A)|^2 |9}}
Po relativně složitém odvození (zahrnujícím vyjádření \boldsymbol E_D pomocí Greenovy funkce, středování vzájemné orientace donoru a akceptoru a další kroky) získáme důležitý vztah pro závislost FRET na vzdálenosti obou zúčastněných dipólů:
{{vzorec| {\gamma_{D \to A} \over \gamma_{0}} = \left [ {R_0 \over R} \right ]^6 |10}}
přičemž R_0 je tzv. Försterova vzdálenost. +more Ze vztahu vyplývá, že intenzita FRET se vzdáleností silně klesá, přičemž intenzitě ostatních deexcitačních procesů se vyrovná, je-li vzdálenost donoru a akceptoru právě R_0. Typické hodnoty R_0 jsou 1-10 nm.
Försterovu vzdálenost lze vyjádřit jako
{{vzorec| R^6_0 = {{9 c^4 \kappa^2} \over {8 \pi}} \int_{V_A}^\infty {{f_D(\omega)\sigma_A(\omega)} \over {n^4(\omega) \omega^4}} \,d\omega|11}}
Zde f_D je emisní spektrum donoru, n je index lomu prostředí. Veličina \sigma_A představuje účinný průřez akceptoru pro danou frekvenci \omega, který vyjadřuje schopnost akceptoru na dané frekvenci absorbovat:
{{vzorec| \sigma(\omega_0) = {{(\omega_0 / 2)\ Im\{\alpha (\omega_0)\}\ \langle |\boldsymbol n_P \cdot \boldsymbol E_D|^2 \rangle} \over {(1 / 2) (\epsilon_0/\mu_0)^{1/2} \ n(\omega_0)\ |\boldsymbol E_D|^2}} = {\omega_0 \over 3} \sqrt{\mu_0 \over \epsilon_0} {{Im\{\alpha (\omega_0)\}} \over {n(\omega_0)}} |12}}
FRET tedy závisí na překryvu emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru.
Faktor \kappa^2, který v rovněž figuruje, vyjadřuje závislost FRET na vzájemné orientaci donoru a akceptoru:
Hodnoty orientačního faktoru pro tři význačné vzájemné orientace donoru vůči akceptoru
Vektor \boldsymbol n_A, resp. \boldsymbol n_D je jednotkový vektor ve směru dipólového momentu akceptoru, resp. +more donoru a \boldsymbol n_R je jednotkový vektor ve směru spojnice donoru a akceptoru.
Výraz \kappa^2 může nabývat hodnot mezi 0 a 4. Minimální hodnotu 0 má v případě, že oba dipólové momenty jsou na sebe kolmé. +more Hodnotu 1 má v případě, že jsou rovnoběžné a zároveň kolmé na \boldsymbol n_R. Maximální hodnotu 4 má v případě, že oba dipóly leží v jedné přímce.
Stojí za povšimnutí, že \kappa^2 (a tedy i intenzita FRET) má nejvyšší hodnotu, leží-li akceptor ve směru osy dipólu donoru. Hodnota E je zde nenulová, na základě výrazu tedy k přenosu energie může dojít, a to přesto, že v aproximaci dalekého pole se tímto směrem nešíří žádné elektromagnetické vlny. +more Proto se jedná o „nezářivý přenos“.
V případě, kdy se donor i akceptor v roztoku průběžně náhodně reorientují, vystředuje se \kappa^2 na hodnotu 2 \over 3. Jsou-li naopak donor a akceptor částečně či zcela fixovány (na stejné makromolekule či v membráně), může se \kappa^2 od hodnoty 2 \over 3 odchylovat. +more FRET pak může poskytnout informaci o vzájemné orientaci donoru a akceptoru.
Účinnost FRET
Tři nutné podmínky FRET: překryv emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru, malá vzdálenost (do cca 10 nm), vhodná vzájemná orientace zúčastněných molekul FRET lze alternativně popsat prostřednictvím účinnosti, která se spočítá jako kvantový výtěžek příslušného přechodu, tedy podíl uskutečněných přenosů vzhledem k počtu excitací. +more Lze ji též vyjádřit pomocí rychlostních konstanty FRET \gamma_{D \to A} a rychlostní konstanty \gamma_0 reprezentující ostatní deexcitační jevy:.
{{vzorec| \eta = {\gamma_{D \to A} \over {\gamma_{D \to A} + \gamma_{0}}} |14}}
To lze po dosazení z upravit na
{{vzorec| \eta = {{1} \over {1 + (r/R_0)^6}} |15}}
Pomocí dob života lze účinnost FRET vyjádřit jako
{{vzorec| \eta = 1\ -\ \tau_D^{'}/\tau_D |16}}
kde \tau_D^{'} a \tau_D jsou doby života excitovaných stavů donoru v přítomnosti, resp. absenci akceptoru.
Aby byla účinnost FRET nenulová, musí být splněny 3 základní podmínky:
#Překryv spekter: donor musí fluoreskovat a jeho emisní spektrum se musí alespoň částečně překrývat s absorpčním spektrem akceptoru. Akceptor naopak nemusí být fluoroforem. +more #Vzdálenost: donor a akceptor od sebe nesmí být dál než několik nanometrů. #Orientace: donor a akceptor vůči sobě nesmí být natočené tak, aby orientační faktor \kappa^2 byl nulový.
Kvantový přístup
V rámci kvantové teorie pole lze interakce mezi částicemi obecně popsat s pomocí Feynmanových diagramů jako výměnu tzv. virtuálních částic. +more FRET lze proto popsat jako výměnu virtuálních fotonů mezi donorem a akceptorem.
Aplikace
V biofyzice a biochemii FRET představuje užitečný nástroj umožňující in vivo kvantifikaci buněčných dějů jako jsou interakce molekul či jejich konformační změny (je ovšem třeba mít k dispozici metodu, kterou lze na tyto molekuly připevnit vhodný donor, resp. akceptor). +more Lze tak však získat pouze informaci o průměrných vzdálenostech donoru a akceptoru (s výjimkou metody smFRET).
Konkrétně se FRET uplatňuje např. v následujících oblastech:
* studium struktury a konformace proteinů * metoda imunoassay * studium struktury a konformace nukleových kyselin * real-time PCR * studium distribuce a transportu lipidů * studium fúze membrán * v přírodě se FRET uplatňuje při svádění světelné energie ze světlosběrné antény do reakčního centra fotosystému
Metody měření FRET
Senzitizovaná emise
Jelikož FRET vede ke snížení intenzity fluorescence donoru, lze jej z měření tohoto poklesu teoreticky určit. Je-li I_{DA}, resp. +more I_D intenzita fluorescence donoru v nepřítomnosti, resp. přítomnosti akceptoru, pak účinnost FRET lze vyjádřit jako.
{{vzorec|\eta=1-{I_{DA} \over I_D}|17}}
V praxi však vždy představuje komplikaci tzv. crosstalk, neboli skutečnost, že excitační, resp. +more emisní spektra donoru a akceptoru se alespoň částečně překrývají. V případě překryvu excitačních spekter pak dochází k nežádoucí přímé excitaci akceptoru, který následně může fluoreskovat i v případě, kdy k FRET nedochází.
V případě překryvu emisních spekter fluorescence donoru a akceptoru částečně splývají. To do měření rovněž vnáší nepřesnost, neboť pokles fluorescence donoru v důsledku FRET se pak jeví menší než ve skutečnosti je.
Proto je nutné zároveň se vzorkem obsahujícím donor i akceptor měřit i kontroly obsahující pouze donor, resp. pouze akceptor, a tyto kontroly od samotného vzorku odečíst. +more To však ve výsledném obraze zvyšuje úroveň šumu. Pro měření malých signálů proto metoda senzitizované emise není příliš vhodná.
Vybělování akceptoru
Po vybělení akceptoru jeho fluorescence zmizí, kdežto fluorescence donoru stoupne Fluoreskuje-li kromě donoru též akceptor, lze k určení intenzity FRET též využít jeho vybělování. +more Měření sestává z následujících kroků: # Měření fluorescence donoru ve vzorku s donorem i akceptorem # Vybělení akceptoru # Měření fluorescence donoru ve vzorku s donorem a vyběleným akceptorem.
V prvním kroku je měřená fluorescence donoru umenšovaná přenosem energie na akceptor prostřednictvím FRET. Po vybělení akceptoru je FRET znemožněn, z rozdílu signálu lze tedy velikost FRET určit.
Výhodou této metody je oproti senzitizované emisi to, že stačí měřit jediný vzorek. Nevýhodou je, že vzorek lze změřit pouze jednou, neboť vybělení akceptoru je nevratné. +more Ve vzorku tedy nelze sledovat dynamiku procesů.
Měření dob života fluorescence
Srovnání konvenční fluorescenční mikroskopie (A, D) a FLIM (snímky: B, E, histogramy: C, F). +more Obrázky představují obarvená buněčná jádra; tmavší oblasti odpovídají místům, kde v důsledku přítomnosti akceptoru dochází k FRET Všechny fluorofory vykazují (multi)exponenciální dohasínání, typicky na nanosekundových škálách. Rychlost dohasínání přitom závisí na řadě faktorů a jevů (včetně FRET), které fluorescenci zháší. Právě toho metoda měření dob života využívá. Postup je podobný jako u metody vybělování akceptoru: napřed se provede měření doby života fluorescence donoru na vzorku s donorem i akceptorem, posléze je akceptor vybělen a vzorek je změřen znovu. Intenzita FRET je potom stanovena z rozdílu v obou vzorcích.
Měření dob života představuje poměrně precizní metodu určování FRET. Vzhledem k tomu, že je sledována pouze fluorescence donoru, může jako akceptor sloužit i nefluorescenční molekula, díky čemuž nedochází k přeslechům v emisních spektrech.
Mezi nevýhody patří, že dobu života fluorescence donoru ovlivňují kromě přítomnosti akceptoru i další faktory prostředí, jako jsou např. změny pH. +more Aparatury schopné měření časově rozlišené fluorescence na nanosekundových škálách se též vyznačují vyšší cenou.
Měření dob života fluorescence se využívá při technice Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Obrazy vzorku pořízené touto metodou odráží rozdíly v dobách života fluorescence v jeho různých místech.
Měření polarizace (Homo-FRET)
Zkratka “FRET” obvykle označuje techniky, při nichž se používá akceptor jiného typu (chemického složení), než je donor. V mnoha situacích je však zapotřebí studovat interakce mezi proteiny stejného typu, nebo dokonce interakci různých částí stejné proteinové molekuly (skládání neboli folding), které jsou značeny stejným fluoroforem (odtud Homo-FRET).
V takovémto případě, kdy donor zároveň plní roli akceptoru (to je možné za předpokladu, že se jeho excitační a emisní spektrum částečně překrývají), nelze FRET měřit sledováním spektrálních změn, neboť emisní spektra obou zúčastněných molekul jsou shodná. Situace, kdy dochází, resp. +more nedochází k FRET však lze přesto rozlišit, a to měřením rozdílu v polarizaci dopadajícího a emitovaného světla. Vzorek excitujeme lineárně polarizovaným světlem. V případě, že k FRET nedochází, je depolarizace nastalé fluorescence způsobena pouze rotací vzorku. Pokud však k FRET dochází, má navíc část emitovaných fotonů polarizaci odlišnou od polarizace dopadajícího světla. To je způsobeno tím, že byly vyzářeny akceptorem, který může mít oproti donoru jinou prostorovou orientaci. Intenzitu FRET pak lze určit z hodnoty veličiny jménem anizotropie.
Bioluminiscenční resonanční přenos energie (BRET)
Nevýhodou FRET je nutnost vzorek osvětlovat externím zdrojem, což může vést ke vzniku šumu způsobeného přímou excitací akceptoru nebo k vybělování. Tomuto problému se lze vyhnout s pomocí techniky zvané Bioluminiscenční Resonanční Přenos Energie neboli BRET. +more Tato technika místo CFP využívá bioluminiscenčních látek označovaných jako luciferiny. Tyto látky jsou s pomocí katalytického enzymu luciferázy schopny podstoupit oxidaci, jejímž produktem je molekula v excitovaném stavu. Ta se následně deexcituje emisí fotonu - nebo právě prostřednictvím FRET.
Single molecule FRET (smFRET)
Při běžném měření FRET je získáván souhrnný signál souboru donor-akceptorových párů ve vzorku, získaná hodnota FRET je tedy hodnotou průměrnou. Při smFRET jsou naopak donor-akceptorové páry sledovány jednotlivě. +more Tímto způsobem je možné monitorovat i drobné změny vzdálenosti a orientace jednotlivých molekul, které by jinými variantami FRET měření kvůli středování nebyly detekovatelné. Sledování jednotlivých donor-akceptorových párů je dosaženo buďto s pomocí konfokálního mikroskopu, který sbírá světlo pouze z určitého optického řezu vzorkem, nebo pomocí tzv. TIRFM mikroskopu využívajícího totální odraz. V takovém případě jsou excitovány jen donory nacházející se blízko rozhraní vzorku s podložkou.
Molekuly využívané při měření FRET
+more8'>Je-li spojovací štěpitelná sekvence neporušená, excitace CFP na vlnové délce 414 nm vede následkem FRET k emisi YFP na vlnové délce 525 nm. Je-li spojovací sekvence rozštěpena proteázou, FRET je přerušen a emituje CFP na 475 nm. Z neproteinových látek se často používá např. pár fluorescein (donor) - rhodamin (akceptor).
Mezi proteiny je častou volbou dvojice modrozelený fluorescenční protein (CFP) - žlutý fluorescenční protein (YFP). Oba proteiny jsou odvozeny ze zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). +more Použití variant GFP ke značení proteinů má oproti použití jiných molekul tu výhodu, že je lze připevnit pomocí genetického inženýrství (modifikací genu značeného proteinu), což může být jednodušší než metody používané ke značení neproteinovými molekulami.
Dalším důležitým proteinem je tzv. Cameleon vytvořený spojením proteinu BFP, kalmodulinu, EGFP a peptidu M13.
Tento protein lze použít jako senzor přítomnosti vápenatých iontů. Každá jeho molekula má donorovou i akceptorovou část a v přítomnosti Ca2+ změní konformaci tak, že dochází k FRET.
Ve variantě FRET zvané BRET jsou jako donory používány látky zvané luciferiny, jejichž fluorescence je spouštěna chemickou reakcí katalyzovanou enzymem luciferázou.