Superrozlišovací mikroskopie

Superrozlišovací mikroskopie je optická mikroskopie umožňující pozorovat objekty s rozlišením vyšším než difrakční limit. Ten při běžné světelné mikroskopii neumožňuje odlišit dva body bližší než přibližně 250 nm Za pokroky ve vývoji těchto metod v roce 2014 získali Eric Betzig, Stefan W. Hell a William E. Moerner Nobelovu cena za chemii.

4Pi mikroskopie

4Pi mikroskop je podobný klasickému konfokálnímu mikroskopu, ale má 2 stejné objektivy, každý na opačné straně vzorku, zaostřené na stejné místo. Obrazy z nich se skládají a ve výsledku tak fungují jako jeden objektiv s dvojnásobku numerickou aperturou, což vede ke zlepšení rozlišení. +more Díky interferenci proti sobě jdoucích paprsků se ještě více zmenšuje objem, do nějž se promítá bod, zejména v axiálním směru. Výsledné laterální rozlišení dosahuje až 100 nm a axilální rozlišení až 190 nm.

Mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM)

+more_Na_obrázku_je_detail_jaderná_membrána|jaderné_membrány:_červeně_jaderný_pór'>jaderné póry (anti-NPC), zeleně jaderný obal (anti-lamin), modře chromatin (DAPI). Měřítko: 1µm. SIM (Structured Illumination Microscopy) využívá osvětlení vzorku světlem s pruhovaným vzorem vzniklým difrakcí na mřížce. Interferencí s detaily vzorku vzniká moiré efekt. Jeho následným počítačovým zpracováním lze spočítat, jak vypadaly struktury, jež ho způsobily, a získat tak obrázek obsahující jemnější detaily s rozlišením okolo 100 nm.

Skenovací optická mikroskopie blízkého pole (NSOM)

NSOM (Near-field Scanning Optical Microscopy) zobrazuje vzorky pomocí skenování sondou nanometrových rozměrů, která slouží jako zdroj světla a/nebo detektor fluorescenčního záření. Jako sonda slouží hrot z průhledného materiálu v neprůhledném obalu, který má na konci miniaturní otvor. +more Otvor je podstatně menší než vlnová délka světla, které tak nemůže projít skrz, v jeho blízkém okolí se však tvoří evanescentní vlna, která dokáže fluorofory excitovat. Její intenzita exponenciálně klesá se vzdáleností, takže oblast, v níž se excitují fluorofory, je menší než difrakční limit, zhruba 100 nm. Nevýhodou této metody je, že z principu dokáže zobrazovat jen povrch vzorku, zároveň ovšem nutně musí sbírat potenciálně zajímavé informace o topologii povrchu.

Vyčerpání stimulovanou emisí (STED)

STED (STimulated Emission Depletion) využívá možnosti vyčerpat energii z fluoroforu stimulovanou emisí. Zároveň s excitačním světlem se fluorofor osvětlí světlem s delší vlnovou délkou, které způsobí, že místo fluorescenčního záření se vyzáří světlo o vlnové délce excitačního záření, které je odfiltrováno. +more Paprsek laseru s vyšší vlnovou délkou má na průřezu tvar mezikruží, takže ke zhášení fluorescence dochází pouze u okraje oblasti osvícené excitačním laserem. Fluorescenční záření tak vzniká pouze v nezhášené oblasti uvnitř mezikruží, čímž dochází ke zlepšení rozlišení. Rozlišení závisí na tom, jak moc dokážeme omezit oblast, v níž nedochází k vyčerpávání fluorescence. Ta je limitována intenzitou záření laseru s delší vlnovou délkou a u biologických vzorků limituje nejlepší dosažitelné rozlišení, protože při přílišné intenzitě osvětlení dochází k poškozování vzorku. V praxi se maximální rozlišení pohybuje okolo 60 nm.

STORM, PALM a FPALM

Metody STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy) , PALM (PhotoActivation Localization Microscopy) a FPALM (Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy) byly nezávisle publikovány krátce po sobě a využívají stejný princip. Fluorofory pro tyto techniky mají dva stavy, jeden schopný fluorescence a druhý fluorescence neschopný, které se dají přepínat světlem různých vlnových délek nebo se přepínají stochasticky. +more Ve stavu schopném fluorescence se nachází vždy jen velmi malý podíl všech fluoroforů, jejichž fluorescence se snímá, dokud nedojde k jejich vybělení. Poté se převede do stavu schopného fluorescence další malá část fluoroforů a snímají se, dokud se nevybělí. Tento postup se opakuje, dokud není nasnímáno dostatečné množství fluoroforů. Fotony nasnímané z jednoho fluoroforu jsou detekovány na širším prostoru podle rozptylové funkce (PSF, point spread function). Poté se matematicky určí střed PSF a danému fluoroforu se přiřadí tato spočítaná souřadnice. Čím více fotonů se detekuje z daného fluoroforu, tím lépe je definovaná PSF a tím přesnější je lokalizace fluoroforu. Lze dosáhnout rozlišení až v jednotkách nm. Jako fluorofory se využívají buď fotoaktivovatelné fluorescenční proteiny (např. PA-GFP) , nebo organické fluorescenční barvy (např. Cy5 spojená s Cy3) . K aktivaci fluoroforu obvykle dochází osvícením laserem s nízkou intenzitou, využívající jinou barvu, než se poté využívá k vybuzení fluorescence. Nevýhodou těchto metod je obvykle delší doba snímání celkového obrazu, protože se musí nasnímat velké množství dílčích obrazů.

File:3D Dual Color Super Resolution Microscopy Cremer 2010. png| File:Single_YFP_molecule_superresolution_microscopy. +morepng| File:GFP Superresolution Christoph Cremer. JPG| File:Label-free Localisation Microscopy SPDM - Super Resolution Microscopy Christoph Cremer. jpg| File:Opthalmology AMD Super Resolution Cremer. png | File:TMV virus super resolution microscopy Christoph Cremer Christina Wege. jpg|.

Reference

Kategorie:Mikroskopy