Metody výzkumu protein-proteinových interakcí

Metody detekce PPI

Detekovat nové PPI umožňují zejména metody afinitní purifikace, ko-imunoprecipitace, kvasinkový dvouhybridový systém a podobné komplementační metody, proteinové čipy (array), blízkostí indukovaná ligace či značení.

Pro všechny tyto metody je typická nízká specificita, výsledkem je značné množství tzv. false-pozitiv výsledků. +more Je proto třeba detekované interakce vždy ověřit nějakou specifičtější metodou. Proč ji nevyužijeme už na začátku. Je pro ni potřebné znát potenciální interakční patnery, které neznáme. Metody detekce PPI jsou primárním screeningem, který nám umožní vyloučit obrovské množství potenciálních interakčních partnerů a vytipuje užší skupinu, kterou můžeme dále analyzovat. Princip afinitní purifikace.

Afinitní purifikace (AP)

Tato metoda může být aplikována jak v in vivo, tak v in vitro podobě. Je relativně nenáročná, levná, nízkoprůchodná - tzn. +more hodí se pro analýzu jednotlivých proteinů, nikoliv na detekci celého interaktomu. Má nízkou specificitu i senzitivitu - detekovány jsou převážně stabilní, silné interakce. Senzitivitu je možné zvýšit při in vitro provedení.

In vitro varianta

Protein našeho zájmu (návnada) je připojen na pevnou matrici (agarózové/magnetické kuličky). Může být připojen kovalentně, či vysokoafinní nekovalentní vazbou (například přes protilátku). +more Následně aplikujeme směs buněčných proteinů na matrici s návnadou. Ty proteiny, které s návnadou interagují, se na ní zachytí. Zbytek neinteragujících proteinů odmyjeme. Dalším krokem je eluce proteinů, které se na naši návnadu chytily, obvykle pomocí roztoku s vysokou koncentrací solí, detergentem, či molekulou kompetující o vazbu návnady. Eluované proteiny je nakonec potřeba identifikovat - typicky pomocí hmotnostní spektrometrie.

Tato metoda má jeden značný problém - proteiny nám interagují v nefyziologických podmínkách. Výsledné interakce mohou být tedy pouze důsledkem denaturace proteinu během izolace, nebo se k sobě dostanou proteiny vyskytující se běžně ve zcela odlišných buněčných kompartmentech.

Zvýšit senzitivitu metody je možné prostřednictvím vysoké koncentrace proteinu našeho zájmu na matrici. V takovém případě je možné zachytit i relativně slabé a transientní interakce.

In vivo varianta

Cílem in vivo afinitní purifikace je izolovat skutečné, fyziologické interakční komplexy, ve kterých se vyskytuje protein našeho zájmu v buňce. Za tím účelem je typicky geneticky modifikován - připojíme k němu určitou značku, s jejíž pomocí ho budeme moct snadno izolovat včetně jeho interakčních partnerů (His tag, FLAG, Myc, HA, GFP, GST, PrA). +more Nebo ho nemodifikujeme a izolaci provádíme pomocí specifických protilátek. Proces purifikace je v principu stejný jako v in vitro případě, opět máme pevnou matrici, na které jsou připojeny specifické protilátky či jiné vysokoafinní molekuly. Ty nekovalentní vazbou zachytí náš protein společně s jeho interakčními partnery. Nespecifické interakce jsou odmyty a to co zůstane eluujeme a identifikujeme hmotnostní spektrometrií.

Hlavní rozdíl od in vitro metody je tedy v tom, odkud přichází protein našeho zájmu. V in vitro případě musí být nejprve purifikován a připojen na matrici. +more V in vivo případě je společně s ostatními proteiny součástí buněčného lyzátu a na matrici se váže později, rovnou ve svém komplexu interakčních partnerů.

Ko-imunoprecipitace (co-IP)

Metoda je hodně podobná afinitní purifikaci. Do buněčného lyzátu přidáme protilátku specifickou k proteinu našeho zájmu. +more Následně přidáme sekundární protilátku či protein A připojené na agarózu. Náš protein společně se svými interakčními partnery se zachytí na agaróze a vzniká imunoprecipitát. Vzorek promyjeme, imunoprecipitáty lze snadno oddělit centrifugací.

Imunoprecipitát můžeme nakonec analyzovat pomocí hmotnostní spektrometrie.

Kvasinkový dvouhybridový systém

Více na samostatné stránce Kvasinkový dvouhybridový systém.

Jedná se o náročnější, senzitivní, genetickou, in vivo metodu. Detekujeme expresi určitého kvasinkového markeru (např. +more β galaktosidázy), která je spouštěna funkčním transkripčním faktorem. Transkripční faktory mají dvě důležité domény, bez nichž nemohou fungovat - transaktivační a DNA-vazebnou. DNA-vazebná doména je fúzována s proteinem našeho zájmu, transaktivační doména s potenciálním interakčním partnerem. Pouze pokud proteiny interagují, domény se dostanou k sobě a spouští expresi markeru, kterou detekujeme. Existují velké knihovny expresních vektorů s fúzemi rozmanitých proteinů k doménám transkripčních faktorů a lze proto simultánně testovat spoustu potenciálních proteinových interakcí. Metoda je vhodná i pro analýzu komplexních interaktomů. Kvasinkový dvouhybridový systém Nevýhod tohoto systému je několik. K interakci proteinových partnerů musí dojít v jádře, aby transkripční faktor fungoval. Metodu proto nelze použít pro proteiny membránové a vyskytující se v jiných buněčných kompatmentech. Kvasinky neumí vytvářet posttranslační modifikace stejné jako savčí buňky - pokud je tedy interakce založena na savčí modifikaci, v kvasince k interakci nedojde. Navíc fúze přídatné domény k proteinu může pozměnit jeho vlastnosti. Typická je také velmi nízká specifita, vedoucí ke vzniku velkého množství false-pozitiv výsledků.

V důsledku slabin tradiční metody bylo odvozeno velké množství vylepšených přístupů, například: * Rekrutace proteinu Sos (son of sevenles) / Ras ** vhodné pro cytoplazmatické proteiny * G proteinový fúzní systém ** vhodné pro interakci mezi membránovým (návnada) a cytoplazmatickým proteinem * Savčí dvouhybridový systém ** fyziologické podmínky, savčí modifikace, folding * A další...

Proteinové čipy

Jedná se relativně drahou, složitou, vysoko-průchodnou in vitro metodu. Umožňuje analyzovat opravdu velké množství proteinových interakcí zároveň. +more Fungují analogicky jako DNA čipy. Kromě studia interakcí s proteiny je lze použít také k detekci interakcí s oligonukleotidy.

Proteinové čipy se skládají z pevné matrice, na níž jsou ukotveny stovky až tisíce různých proteinů. Na jednom čipu se tak může nacházet celý proteom daného organismu. +more Nejnáročnější je tvorba čipu. Jednotlivé proteiny je potřeba vypurifikovat z buněk, nebo je in vitro syntetizovat. Pomocí in vitro syntézy je možné přepsat celou cDNA knihovnu do podoby čipu. Vazba interakčního partnera na čip je detekována typicky fluorescenčně.

Slabinou čipů je, že se jedná o in vitro proces. Imobilizace proteinů na matrici může ovlivnit jejich strukturu a interakční vlastnosti. +more Navíc pokud jsou proteiny syntetizovány in vitro, nebo exprimovány v bakteriálním systému, nebudou posttranslačně modifikovány.

Blízkostí indukovaná ligace

Tato metoda nám umožňuje kovalentně provázat proteinový komplex in vivo, v buňce. Díky tomu jsme schopni zachytit i proteiny interagující slabě, či pouze dočasně s proteinem našeho zájmu. +more Pevně svázaný komplex pak můžeme izolovat třeba pomocí afinitní purifikace a analyzovat na hmotnostním spektrometru. Díky kovalentnímu provázání nám při izolaci "neodpadne" žádný z interagujících proteinů a my tak můžeme intenzivně promývat a zbavit se pozadí.

Ke kovalentnímu propojení se používá obvykle bifunkčních činidel, kdy dvě reaktivní funkční skupiny jsou odděleny řetízkem (linkerem) určité délky. Délka řetízku určuje maximální vzdálenost, ve které je možné proteiny propojit. +more Reaktivní skupiny mohou být různého typu a cílit tak na konkrétní aminokyseliny proteinu - typicky jsou propojovány amino- a sulfhydrylové skupiny. Některá činidla jsou UV-aktivovatelná a ligaci je tak možné spustit v konkrétní čas. Jiná prochází samovolně přes membrány a buňky není třeba permeabilizovat.

Provazování proteinů, které jsou v blízkosti proteinu našeho zájmu, s sebou nese nebezpečí propojení pouze náhodně "kolemjdoucích" proteinů.

Blízkostí indukované značení

Podobně jako předchozí metoda je blízkostí indukované značení zacíleno na zachycení všech interakcí našeho proteinu, včetně slabých a transientních in vivo. Je založena na fúzi proteinu našeho zájmu k enzymu, který připojí afinitní značku na proteiny v jeho bezprostředním okolí. +more Prostřednictvím značky je následně snadné označené interakční partnery vyizolovat a analyzovat na hmotnostním spektrometru. Tuto metodu lze dobře použít i pro membránové proteiny, které lze jen těžko solubilizovat. Nevýhodou je opět značení všech proteinů do určité vzdálenosti, tedy ne nutně pouze těch, které s naším proteinem opravdu interagují.

Jako afinitní značka je užíván zejména biotin. Biotinylace je v savčích buňkách vzácnou modifikací, navíc afinita biotinu k avidinu umožňuje snadnou izolaci. +more Některé enzymy vyloženě katalyzují připojení biotinu - tzv. biotin-ligázy, jiné tvoří reaktivní biotinové molekuly, které se následně ochotně vážou na aminokyseliny ve svém okolí. Dvěma nejznámějšími metodami jsou BioID (biotin-ligáza) a APEX (askorbát-peroxidáza).

Další metody pro analýzu protein-proteinových interakcí

FRET V okamžiku, kdy známe dva potenciální interakční partnery, nabízí se nám nepřeberné množství metod, jimiž je můžeme dále studovat a ověřovat.

Skvělou metodou je v tomto směru FRET(Försterův rezonanční přenos energie), či FCS(fluorescenční korelační spektroskopie), které nám umožňují pozorovat proteinový komplex pomocí fluorescence in vivo v buňkách, v reálném čase. FRET navíc umožňuje určení například KD komplexu.

In vitro metodami jsou například NMR, rentgenová krystalografie, CD (cirkulární dichroismus), SPR(povrchová plazmonová rezonance) a další. Mohou nám poskytnout velmi detailní pohled na interakční rozhraní partnerů.

Reference

Kategorie:Bílkoviny Kategorie:Molekulárně biologické metody