Cesko.wiki DNA
Author
Albert FloresStruktura dvoušroubovice DNA. V této formě se vyskytuje většina DNA například v lidských buňkách. Dvoušroubovice je tvořena dvěma řetězci nukleotidů Deoxyribonukleová kyselina, běžně označovaná DNA (z anglického deoxyribonucleic acid, česky zřídka i DNK), je nukleová kyselina, nositelka genetické informace všech organismů s výjimkou některých nebuněčných, u nichž hraje tuto úlohu RNA (např. RNA viry). DNA je tedy pro život velmi důležitou látkou, která ve své struktuře kóduje a buňkám zadává jejich program, a tím předurčuje vývoj a vlastnosti celého organismu. U eukaryotických organismů (jako jsou např. rostliny a živočichové) je DNA hlavní složkou chromatinu, směsi nukleových kyselin a proteinů, a je uložena zejména uvnitř buněčného jádra, zatímco u prokaryot (jako jsou např. bakterie a archea) se DNA nachází volně v cytoplazmě.
DNA je biologická makromolekula - polymer v podobě řetězce nukleotidů. Nukleotidy jsou vždy složeny z cukru deoxyribózy, fosfátové skupiny a jedné ze čtyř nukleových bází. +more Informační funkci mají právě báze, jimiž může být adenin A, guanin G, cytosin C nebo thymin T. První dvě patří mezi puriny, zbylé mezi tzv. pyrimidiny. Dvě vlákna DNA se často spojují a vytvářejí dvoušroubovici, jejíž tvar je tak slavný, že se stal kulturní ikonou moderní doby. Dvoušroubovici DNA tvoří dvě navzájem spletené šroubovice, každá mířící opačným směrem (jsou antiparalelní). Mezi protilehlými bázemi obou vláken se vytvářejí vodíkové můstky, a to tři mezi guaninem a cytosinem nebo dva mezi adeninem a thyminem. Existují i jiné způsoby uspořádání řetězců, vymykající se tradiční představě dvoušroubovice.
Deoxyribonukleová kyselina je středem zájmu vědců nejen z biologických oborů a byly vyvinuty promyšlené techniky její izolace, separace, barvení, sekvenování, umělé syntézy a manipulace s ní pomocí metod genového inženýrství. Všechny tyto postupy jsou důležité i pro lékaře, kriminalisty či evoluční biology - DNA je zásadním materiálem v diagnostice nemocí, testech otcovství, při vyšetřování zločinů, přípravě plodin s novými vlastnostmi či třeba hledání příbuzenských vztahů mezi organismy.
Historie výzkumu
Deoxyribonukleová kyselina byla popsána roku 1869, kdy švýcarský lékař Friedrich Miescher zkoumal složení hnisu z nemocničních obvazů. Z jader bílých krvinek přítomných v tomto hnisu získal jisté množství nukleových kyselin, které souhrnně nazýval nuklein. +more Na počátku 20. století Phoebus Levene rozpoznal, že DNA se skládá z cukrů, fosfátů a bází.
O funkci DNA toho dlouho nebylo moc známo. První důkaz o roli DNA v přenosu genetické informace přinesl v roce 1944 Averyho-MacLeodův-McCartyho experiment, který provedli Oswald Avery společně s Colinem MacLeodem a Maclynem McCartym. +more Sérií pokusů s transformací pneumokoků zjistili, že DNA je genetickým materiálem buněk. Další důkaz přinesl v roce 1952 Hersheyho-Chaseové experiment.
Patrně nejslavnějším milníkem ve výzkumu DNA bylo odhalení její trojrozměrné struktury. Správný dvoušroubovicový model poprvé představili v roce 1953 v časopise Nature James D. +more Watson a Francis Crick, pozdější laureáti Nobelovy ceny. Vycházeli přitom z rentgenové difrakční analýzy, kterou o rok dříve provedli Rosalind Franklinová a Raymond Gosling a publikovali ve stejném čísle Nature. Další článek v tomto vydání předložil i Maurice Wilkins. V roce 1957 předložil v té době již slavný Crick sérii pravidel, které se označují jako centrální dogma molekulární biologie a popisují vztahy mezi DNA, RNA a proteiny. O rok později slavný Meselsonův-Stahlův experiment umožnil poznat způsob replikace DNA v buňkách. Genetický kód rozluštili na počátku 60. let Har Gobind Khorana, Robert W. Holley a Marshall Warren Nirenberg.
Původ
Přítomnost nukleových kyselin, tedy DNA a RNA, je společnou vlastností všech známých pozemských organismů. Veškerý život je založen na koexistenci těchto nukleových kyselin s bílkovinami, nicméně není zcela jasné, jak se vztah mezi DNA a bílkovinami vyvinul. +more Podle některých hypotéz nejprve existovaly bílkoviny a až následně vznikly nukleové kyseliny, nicméně nejvíce příznivců má zřejmě v současnosti představa, že prapůvodní látkou byla nukleová kyselina, která byla schopna biologické evoluce. Podle teorie RNA světa však hlavní roli hrála nejprve spíše RNA a teprve posléze přejala hlavní roli DNA. Doklady ve prospěch takových hypotéz jsou však vždy nepřímé, protože nejsou k dispozici dostatečně staré vzorky DNA. Život vznikl již před několika miliardami let, jenže už po několika desítkách tisíců let klesá množství DNA na setinu původního stavu. Studie v časopise Nature z let 2000 a 2002 nicméně popisují nález až 450 milionů let starých vzorků bakteriální DNA uchovaných v solných krystalech, dále existuje i řada dalších, více nebo méně spolehlivých studií.
Stavba
+more3|Chemická_struktura_krátkého_úseku_DNA:_v_každém_ze_čtyř_nukleotidů_je_deoxyribóza,_Fosforečnany'>fosfátová skupina a dále jedna náhodná nukleová báze (ze čtyř možných) Stavbu DNA je možno zkoumat na několika úrovních. Pořadí nukleotidů v lineárním dvouvlákně je záležitostí tzv. primární struktury. Stáčení vlákna do dvoušroubovice se označuje jako sekundární struktura DNA. Konečně pod tzv. terciární strukturou se rozumí obvykle nadšroubovicové vinutí, které usnadňuje kondenzaci DNA.
Chemická struktura
DNA vlastně není nic jiného než velmi dlouhý lineární řetězec nukleotidů. Například uvnitř každého virionu planých neštovic se nachází DNA o délce 193 mikrometrů, kruhová DNA u Escherichia coli má délku 1 600 µm (1,6 mm), lidský genom je rozložen do 23 lineárních molekul DNA (v haploidním stavu) o celkové délce 1 metru. +more Nukleotid je základní stavební jednotkou všech molekul DNA; existují přitom čtyři základní typy nukleotidů, jež se v DNA přirozeně vyskytují. Tyto čtyři nukleotidy (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) se navzájem liší typem přivěšené nukleové báze, jíž může být především adenin, guanin, cytosin či thymin. Důležité je, že každý nukleotid má tři důležité stavební součásti: * deoxyribóza - pětiuhlíkový cukr (pentóza), který se v DNA vyskytuje v cyklické furanózové formě. Jeho uhlíky se po směru pohybu hodinových ručiček označují 1', 2', 3', 4' a 5', přičemž na 1' uhlíku je navěšena nukleová báze, na 3' a 5' uhlíku jsou přes OH skupinu připevněny fosfátové skupiny; * fosfát - vazebný zbytek kyseliny ortofosforečné, který je navázán na 5' uhlíku každého nukleotidu. Záporný náboj na fosforečnanu je důvodem celkového negativního náboje DNA. Fosfátová skupina je můstek propojující 5' uhlík každé deoxyribózy s 3' uhlíkem předchozí deoxyribózy. Výsledkem je tzv. cukr-fosfátová kostra DNA. * nukleová báze - dusíkatá heterocyklická sloučenina. V DNA se v různých kombinacích vyskytují především čtyři základní nukleové báze, dvě purinové (adenin A a guanin G) a dvě pyrimidinové (thymin T a cytosin C). Jedna z těchto čtyř nukleových bází je připojena na 1' uhlíku deoxyribózy pomocí N-glykosidové vazby. Právě existence čtyř nukleových bází je zásadní pro informační vlastnosti DNA. Důležitá je také schopnost nukleových bází vytvářet celou řadu vodíkových můstků.
Primární struktura DNA se dá znázornit jako lineární řada nukleotidů nebo třeba jako řada písmen, které odpovídají dusíkatým bázím v těchto nukleotidech. Dále je důležité, že DNA je směrovaná (direkcionalizovaná), tzn. +more dají se jednoznačně odlišit oba konce. Směr vláken se označuje právě podle orientace deoxyribózy v něm, tedy: směr 3'→5' a opačný směr 5'→3'. Podle konvence se pořadí nukleotidů zapisuje směrem 5'→3' (např. TACGGACGGG AGAAGCGCGC GGGCGGGCCG je prvních 30 z 3 675 nukleotidů tvořících přepisovanou část genu pro lidský alfa-tubulin).
V roce 2011 se objevila zpráva o existenci bakterií GFAJ-1, která údajně ve své DNA obsahuje místo fosfátových skupin arseničnany. Hypotéza byla definitivně vyvrácena v r. +more 2012.
Uspořádání řetězců
Deoxyribonukleová kyselina (DNA) může existovat jako samostatná jednovláknová molekula (tzv. ssDNA), nicméně velmi často vytváří vícevláknové struktury, které jsou složené z několika řetězců spojených vodíkovými můstky. +more Vodíkové můstky jsou jedním z typů poměrně slabých vazebných interakcí, mezi dvěma či více vlákny DNA jich však může vzniknout obrovské množství; výsledná vícevláknová struktura tak je poměrně stabilní. Typickou formou takového vícevláknového uspořádání DNA je dvoušroubovice, notoricky známá molekula DNA (připomínající „stočený žebřík“) tvořená dvěma lineárními řetězci. Aby vznikla pravidelná struktura s velkým množstvím vodíkových můstků, je žádoucí, aby se vedle sebe „v příčli žebříku“ vyskytovaly vždy určité nukleové báze, které spolu ve správném prostorovém uspořádání vytváří několik vodíkových můstků. V typickém případě (ne však vždy) se nukleové báze spojují navzájem s odpovídající bází podle jednoduchého klíče: * A se páruje s T (vzájemně jsou spojeny dvěma vodíkovými vazbami) * G se páruje s C (vzájemně jsou spojeny třemi vodíkovými vazbami) Jedná se o tzv. komplementaritu bází, z ní vychází vzájemná komplementarita obou vláken DNA. Vždy je na určité pozici v molekule jeden nukleotid z dvojice a v protějším vlákně druhý z nich. Takto se uchovává v každém z vláken tatáž informace, i když jedno z vláken je „negativem“ vlákna druhého - podle jednoho vlákna je možné přiřazením komplementárních bází vytvořit vlákno druhé. Poměr AT a GC párů v molekule DNA je velmi různý: tzv. obsah GC se pohybuje u bakterií od 25 do 75 %, u savců v rozmezí 39-46 %.
Existuje celá řada dalších možností, jak pomocí vodíkových můstků spárovat báze, neboť atomů schopných podílet se na vzniku vodíkových vazeb je na molekulách purinů i pyrimidinů celá řada. Samostatnou kapitolou je tzv. +more hoogsteenovské párování pojmenované podle Karsta Hoogsteena, který je v 60. letech 20. století jako první popsal. Jinou možností je tzv. wobble párování, které umožňuje úsporné rozeznávání kodonů pomocí tRNA molekul. Při wobble párování může například guanin vytvářet vazbu s uracilem; někdy je rekrutován inosin, jenž má velmi obecné vazebné schopnosti a je schopen vázat se na C, A a U.
Kromě vodíkových můstků se uplatňuje hydrofobie.
Dvoušroubovice
Animace otáčejícího se prostorového modelu dvoušroubovice B-DNA
V drtivém procentu případů se DNA za běžných podmínek uchovává ve formě pravotočivé dvoušroubovice. Dvoušroubovice DNA je tvořena dvěma vlákny DNA, které se obtáčí kolem společné osy a interagují spolu. +more Vlákna jsou tzv. antiparalelní, tzn. směřují opačnými směry - zatímco jedno vlákno můžeme jedním směrem popsat jako 5'-3', druhé je ve stejném směru 3'-5'. Čísla 3' a 5' označují čísla uhlíku na deoxyribóze, na které se upínají fosfátové skupiny v cukr-fosfátové kostře DNA. Mezi bázemi v rámci jednoho „patra“ dvoušroubovice platí pravidla Watson-Crickovské komplementarity.
Existuje několik tzv. helikálních forem (konformací) DNA, které se liší celou řadou parametrů. +more Typická Watson-Crickovská pravotočivá dvoušroubovice (tzv. B-DNA) je nicméně zcela převažující a ostatní formy (zejména pravotočivá A-DNA a levotočivá Z-DNA) se sice mohou vyskytovat i v podmínkách živé buňky, nicméně spíše vzácně a jen za specifických okolností.
Jiná uspořádání řetězců
G-kvartet je jednou ze známých alternativních struktur DNA, jež se vyskytují v buňkách V obecném povědomí DNA tvoří dvoušroubovici, nicméně existují i jiné způsoby uspořádání. +more Některé se vyskytují i v buňkách (in vivo), jiné jsou spíše laboratorní záležitost. Mnohdy se využívá neobvyklých párovacích míst na molekulách bází. To je případ tzv. G-kvartetů, čtyřvláknových úseků DNA v telomerických oblastech chromozomů, v nichž do kruhu párují čtyři guaninové báze. Co se týče trojšroubovice DNA, možná dočasně vzniká při tzv. crossing-overu; laboratorně může být trojvláknová struktura připravena např. z vláken poly(A) a polydeoxy(U).
DNA se také může větvit a vznikají např. třívláknová či čtyřvláknová spojení. +more V některých případech dvoušroubovicová DNA na jednom svém konci lokálně denaturuje a na uvolněné konce se připojí třetí řetězec - v prostředí buňky by tato struktura mohla vznikat při crossing-overu, pokud nedošlo k replikaci v jednom z genomů. Jindy takto vlastně denaturují dvě dvoušroubovice a vzájemně se komplementárně přiloží, čímž vzniká čtyřvláknové spojení. V případě crossing-overu se jedná o známý Hollidayův spoj, který umožňuje vlastní výměnu homologních vláken. Při replikaci DNA či při opravě DNA mohou větvení vznikat také. V laboratoři nicméně vznikají ještě mnohem fantastičtější prostorové struktury DNA - byly vyrobeny např. krychle či osmistěn složené celé pouze z DNA molekul. Tyto a další syntetické struktury DNA jsou v centru zájmu DNA nanotechnologů.
Vyšší úrovně struktury
Genom, tedy souhrn DNA v buňce, není pouhou změtí dvoušroubovicové DNA - na vyšších úrovních je možné pozorovat komplikované vinutí a četné interakce s buněčnými bílkovinami. Tyto struktury také nesou genetickou informaci. +more Zcela typické je tzv. nadšroubovicové vinutí (supercoiling), tedy dodatečné šroubovicové vinutí již existující dvoušroubovice. Nadšroubovicové vinutí se dá zjednodušeně představit tak, že držíme v každé ruce jeden z obou konců provázku a postupně na jednom konci provázek kroutíme. Vzniklé napětí se opět uvolní (relaxuje) jen tehdy, pokud uvolníme jednu ruku. Dvoušroubovice je však stočená již ve svém relaxovaném stavu (jedna otáčka každých cca 10 párů bází), a tak můžeme rozlišit, zda se nadšroubovice vine stejným směrem, jako dvoušroubovice (tzv. pozitivní supercoiling), nebo směrem opačným (negativní supercoiling, uvolňuje DNA). Nadšroubovicové vinutí má celou řadu důležitých funkcí a regulačních rolí; v žádném případě se nejedná pouze o anomálii ve struktuře.
DNA se v buňce dále organizuje do mikroskopicky pozorovatelných útvarů známých jako chromozomy. U bakterií je zřejmě systém kondenzace DNA do (obvykle jediného) chromozomu poněkud méně propracovaný a např. +more u Escherichia coli zahrnuje několik proteinů, které jsou schopné udržovat nadšroubovicové vinutí a vytvářet ostré ohyby vlákna DNA. Eukaryotické organismy, jako je třeba člověk, mají velmi komplikovaně sbalenou DNA. Souvisí to s délkou jejich DNA - např. lidský genom má na délku dva metry, přitom buněčné jádro má na délku několik mikrometrů. Dvouvlákno DNA se nejprve nabaluje na bazické proteiny známé jako histony; DNA nabalená na osm histonů vytváří tzv. „nukleozom“, a tak na této úrovni DNA vypadá jako řada korálků (nukleozomů) na provázku (DNA). Tyto korálky se však obvykle ještě stáčí do 30 nanometrů tlusté šroubovice. Na vzniku chromozomů se podílí ještě vyšší úrovně sbalení DNA, které jsou však méně prostudované a vznikají jen v určitých fázích buněčného cyklu.
Vlastnosti
Vzestup absorbance jako měřítko denaturačního procesu nukleových kyselin (viz text) DNA je polymerní sloučeninou s vysokou molární hmotností. +more Molární hmotnost závisí na délce DNA a zhruba platí, že s každým nukleotidem stoupá molární hmotnost o 330 g/mol, v případě dvouvláknové DNA na jeden pár bází připadá asi 650 g/mol. Deoxyribonukleová kyselina je záporně nabitá (díky fosforečnanovým skupinám), a je tedy polárního charakteru. Díky tomu je rozpustná ve vodě, naopak v ethanolu se sráží (neboť dochází k vyvázání záporných nábojů). Po vysrážení má DNA bílou barvu. Izolovaná DNA zaujímá dvoušroubovicové uspořádání, to je však možné rozrušit v procesu denaturace. Typicky se denaturace provádí zvýšením teploty, ale denaturaci způsobuje i nízká iontová síla roztoku nebo silně zásadité prostředí. Naopak kyselé prostředí není vhodné, protože dochází k hydrolýze glykosidových vazeb mezi cukrem a bází. DNA absorbuje v UV oblasti s absorpčním maximem při vlnové délce 260 nm. Při denaturaci DNA se absorbance v této oblasti zvyšuje - tomuto jevu se říká hyperchromní efekt. Je to dáno tím, že na absorpci se v největší míře podílejí báze DNA, které jsou v dsDNA „schované“ uvnitř dvoušroubovice. Po denaturaci dochází k „obnažení“ bází, které tak mohou lépe absorbovat UV záření.
Poločas rozpadu DNA činí dle studia kosterních nálezů asi 521 let. DNA je považována za stabilní molekulu, což vynikne zejména při srovnání s RNA jakožto druhou významnou nukleovou kyselinou. +more V molekule DNA není na 2' uhlíku OH skupina - u RNA tam tato reaktivní skupina je a způsobuje nižší stabilitu RNA. DNA se v laboratoři dlouhodobě skladuje při −20° nebo −70 °C, kde vydrží i několik let. Při teplotě 4 °C v TE pufru vydrží několik týdnů. Existuje mnoho různých metod k uchování DNA na delší čas (zmrazení vzorků tekutým dusíkem, FTA karty, plastové mikrozkumavky, uchování pomocí chitosanu). Uvnitř těl živých organismů však DNA musí snášet i poměrně vysoké teploty, a přesto vydrží. Krajním případem jsou hypertermofilní organismy, které žijí i při teplotách kolem 100 °C. Jejich DNA čelí jak riziku denaturace, tak i termodegradaci (rozpadu pevných chemických vazeb). Přesto žijí a mimo opravných mechanismů k tomu zřejmě přispívá i nadšroubovicové vinutí a také optimální iontové složení cytoplazmy.
Pro DNA jsou však dále typické i některé vlastnosti, které ji do jisté míry odlišují od běžných chemických látek. V buňce je například možné replikovat DNA, tedy vytvářet její kopie. +more Víceméně každé buněčné dělení vyžaduje zmnožení genetické informace, aby jí v každé buňce bylo stále konstantní množství. V průběhu procesu se oddělí řetězce mateřské DNA a oba slouží jako návod (tzv. „templát“) pro tvorbu druhých vláken v rámci obou nově vznikajících dvoušroubovic. Ty jsou následně napůl tvořeny původní DNA a napůl nově dosyntetizované - celý proces je semikonzervativní. K dalším zajímavým vlastnostem DNA v buňkách patří možnost opravovat DNA, což ještě dále vylepšuje (už tak poměrně precizní) přenos genetické informace. Bylo by možno najít množství dalších pozoruhodných vlastností DNA, vesměs probíhajících v buňce za pomoci speciálních enzymů.
Funkce
sekvenování (graf výše vzniká snímáním fluorescenčních značek při určitých typech sekvenování)
DNA je nositelkou genetické informace všech živých organismů v pravém slova smyslu, ale i mnoha virů. V DNA je zapsána sekvence všech bílkovin a přeneseně je genetickou informací podmíněna existence všech biomolekul a buněčných struktur (k jejichž tvorbě jsou potřeba bílkoviny). +more Schopnost ukládat a přenášet genetickou informaci je jednou z fundamentálních vlastností života. Bez DNA buňky vydrží žít jen omezenou dobu; například lidské červené krvinky při svém zrání vyvrhují jádro, a protože pak nejsou schopné vyrábět nové bílkoviny a udržovat buňku, jsou po několika měsících poškozeny a musí se z oběhu odstraňovat. Některé viry jsou sice schopné uchovávat svůj genetický materiál v podobě RNA (tzv. RNA viry), jenže RNA genomy nepodléhají opravným mechanismům a rychle mutují, a proto mají limitovanou velikost. Život, tak jak ho známe, je proto závislý na DNA.
Konkrétní uložení DNA v buňce závisí na příslušnosti organismu k jedné z dvou základních skupin organismů. Bakterie a archea (souhrnně „prokaryota“) mají DNA obvykle uloženu volně v cytoplazmě. +more Obvykle vzniká pouze jistá jaderná oblast, tzv. nukleoid. Mimo to řada bakterií vlastní i malé kruhové molekuly DNA, tzv. plazmidy, které umožňují mimo jiné horizontální výměnu genetické informace. Zbylé organismy, tedy např. člověk, ale i rostliny, živočichové či prvoci, mají DNA uloženu především v buněčném jádře. Dále však se DNA nachází v některých eukaryotických organelách, jmenovitě v mitochondriích a v plastidech, pokud je buňka vlastní (jev zvaný mimojaderná dědičnost).
Informace nesená sekvencí nukleotidů v DNA se označuje jako genetická informace. Na každé nukleotidové pozici se nachází jedna ze čtyř bází (A, C, G či T), což znamená, že sekvence o délce n může nabývat 4n stavů. +more Pro DNA dlouhou pouhých 10 nukleotidů existuje tedy teoreticky 410 = 1 048 576 kombinací. Lidský genom (souhrn lidské jaderné DNA) přitom obsahuje 3,1 miliardy (párů) bází. Nejvyšší informační hodnota se přitom v genomu objevuje v místech, kde sídlí tzv. geny, která zaznamenávají informaci pro tvorbu RNA a potažmo i všech bílkovin. Informace pro tvorbu bílkovin je zašifrována pomocí třípísmenného kódu známého jako genetický kód. Každé trojici bází v DNA totiž u protein-kódujících genů odpovídá určitá aminokyselina. Aminokyseliny jsou základní stavební kameny bílkovin, takže je vlastně genetická informace jakýmsi návodem na výrobu bílkovin. Genetická informace je uplatňována podle tzv. centrálního dogmatu molekulární biologie. DNA je nejprve přepisována v RNA (obvykle tzv. messenger RNA), načež je tato RNA použita jako vzor pro tvorbu bílkovin. První zmíněný krok se jmenuje transkripce, druhý translace.
Velká část genomu mnoha organismů však není součástí žádného genu a dokonce se ani nepřepisuje v RNA. Role této tzv. +more nekódující DNA je v mnoha případech neznámá; někdy však pomáhá regulovat spouštění a vypínání okolních genů. Velká část nekódující DNA dle současné úrovně znalostí nemá žádnou konkrétní funkci a označuje se prostě jako junk (odpadní) DNA. Část této odpadní DNA však podle výsledků projektu ENCODE ve skutečnosti kóduje různé krátké regulační RNA; celkem se odhaduje, že 10-20 % genomu má díky těmto RNA významnou regulační funkci. V těsném okolí těchto regulačních sekvencí se tak podle ENCODE celkem nachází až 95 % lidského genomu.
Práce s DNA
Izolace a separace
UV lampou jsou patrné fluoreskující DNA „bandy“ V celé řadě případů je žádoucí izolovat z buněk či z virových partikulí jejich DNA. +more Existuje samozřejmě celá řada metod extrakce DNA, nicméně u všech je nutné získat dostatečné množství biologického materiálu, uvolnit DNA a oddělit ji z nadmolekulárních struktur, načež je nutné vzorek přečistit a případně zahustit. Důležitým krokem je uvolnění DNA z buněk, které se u živočišných buněk provádí pomocí detergentů (povrchově aktivních čisticích látek), jež rozrušují membrány. U buněk s buněčnou stěnou je to komplikovanější a je nutné nasadit třeba lysozymy (na bakteriální buněčnou stěnu) či mechanickou degradaci. Co se týče přečišťování buněčných extraktů, obvykle je nutné se zbavit bílkovin, které představují hlavní kontaminaci vzorků. Je možné použít proteázy, ale mnohdy se proteiny sráží fenolem a chloroformem, zatímco nukleové kyseliny zůstanou v roztoku a je možné je pak vysrážet třeba ethanolem.
Po izolaci DNA následuje často separace (oddělení) požadovaných druhů molekul. Může být žádoucí oddělení třeba plazmidů od genomové DNA bakterií, což se dělá poměrně jednoduše centrifugací při vhodně nastavených parametrech, obvykle pomocí denaturace a následné renaturace. +more Pro jemnější rozdělování podle velikosti i podle topologie DNA se často používá elektroforéza na agarózovém (či v případě velmi malých molekul na polyakrylamidovém) gelu. V případě extrémně velkých fragmentů DNA se užívá tzv. pulzní gelová elektroforéza. Z gelu je možné následně DNA převést na nitrocelulózovou membránu pomocí tzv. Southernova přenosu. Další metodou dělení DNA je centrifugace v hustotním gradientu, obvykle v gradientu chloridu cesného - tato metoda odděluje zejména fragmenty, jež se liší zastoupením bází (obsahem GC).
Barvení
malého žlábku a specificky tak označuje buněčnou DNA; na obrázku je DAPI fialově Byl vyvinut nespočet způsobů, jak obarvit DNA - a to jak přímo v buňce, tak i DNA izolovanou v laboratorním skle. +more Používají se často v laboratořích ve chvíli, kdy je nutné např. v elektroforetickém gelu či přímo ve fixované buňce zvýraznit DNA. Ke známým takovým barvivům patří (bez logické následnosti): SYBR Green, YOYO-1, TOTO-1, TO-PRO, SYTOX Green, ale i klasický ethidiumbromid a propidiumjodid, akridinová oranž, různá Hoechst barviva či třeba DAPI. K velmi specifickým barvícím metodám patří fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která umožňuje navázání fluorescenčních sond na konkrétní sekvenci DNA.
Sekvenování a umělá syntéza
+more_Obvykle_se_provádí_v_Eppendorfova_zkumavka'>Eppendorfových zkumavkách (na obrázku každá z nich obsahuje 100mikrolitrovou reakci) Sekvenování DNA je souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje pořadí nukleových bází v sekvencích DNA. Právě pořadí bází je princip zakódování genetické informace, a proto je v centru zájmu biologů. Původní a po dlouhá léta převažující metodou bylo tzv. Sangerovo sekvenování, které využívá speciálně chemicky upravených nukleotidů, jež jsou pomocí DNA polymerázy zařazovány s určitou pravděpodobností do prodlužující se DNA - tím blokují další polymeraci a výsledný produkt je možné detekovat pomocí elektroforézy. V souvislosti se snahou zrychlit a zlevnit sekvenovací proces byla vyvinuta celá řada sekvenačních metod nové generace. K těm patří např. pyrosekvenování a příbuzné metody. Studie Zhang et al. 2011 uvádí pět moderních metod, jež jsou komerčně dostupné: Roche GS-FLX 454 („454 sekvenování“), Illumina („Solexa“), ABI SOLiD, Polonator G. 007 a Helicos HeliScope.
Existuje i celá řada postupů, jak si připravit či namnožit konkrétní molekulu DNA. Jednou z možností je chemická syntéza DNA, při níž dochází k sestavování krátkých oligonukleotidů, a to postupným řazením nukleotidů za sebou. +more V typickém případě však již je určité množství DNA k dispozici a je žádoucí ho pouze zmnožit tak, aby všechny kopie měly pokud možno totožnou sekvenci. To se často dělá buď pomocí klonování DNA nebo metodou polymerázové řetězové reakce.
Význam ve společnosti
Lékařská diagnostika
Vědecký pokrok v oblasti genetiky způsobil boom v mnoha oblastech lékařské diagnostiky. Například v bakteriologii, virologii a parazitologii se uplatnily metody, jež umožňují v napadené tkáni detekovat DNA pocházející z mikroorganismů, jež tuto tkáň napadly. +more To se dělá buď pomocí různých DNA prób schopných se specificky vázat na určitou sekvenci typickou pro daného parazita, nebo např. cestou namnožení DNA pomocí polymerázové řetězové reakce a následným sekvenováním - tím je možné získat sekvenci DNA patogenních organismů, jíž mikrobiologové srovnají s databázemi patogenních kmenů. Tyto pokročilé molekulární metody se uplatňují např. při identifikaci těžko kultivovatelných bakterií či při určování celé řady virových či parazitárních onemocnění.
Součástí diagnostické práce je však i studium lidské DNA - uplatňuje se například v rakovinné terapii či při diagnostice některých genetických onemocnění. Své místo již molekulární metody našly v prenatální diagnostice chorob, např. +more ze vzorku plodové vody. Další testy se rutinně provádí z kapky krve novorozenců. Testy DNA v rámci genetického poradenství však dnes mohou pomoci i párům, jež teprve dítě plánují. Je to vhodné tehdy, vyskytuje-li se v rodinné historii nějaké genetické onemocnění. Dnes jsou genetické testy dostupné všem zájemcům a je možné o sobě zjistit celou řadu informací od těch zřejmých (barva očí) přes různé zajímavosti (atletické vlohy) až po vážné údaje (náchylnost k rakovině atp. ).
Genetická daktyloskopie
Rozdíly mezi 6 jedinci prokázané analýzou jednoho z VNTR markerů
Některé oblasti např. lidské jaderné DNA jsou velmi proměnlivé a člověk od člověka se v nich téměř vždy liší. +more Z tohoto důvodu je DNA v kriminalistice a v forenzních vědách neocenitelným zdrojem informací. Repetitivní sekvence známé jako VNTR či STR patří mezi ty nejčastěji studované. Studium VNTR repetic vyžaduje relativně velké množství DNA, a proto se využívá zejména tehdy, máme-li k dispozici vzorek krve (např. u testů otcovství). Obvykle se testují metodou RFLP (jenž zkoumá polymorfismus délky restrikčních fragmentů). V kriminalistice našly větší využití tzv. STR (čili ~mikrosatelity). Pravděpodobnost, že dvě osoby budou mít jednu STR oblast shodnou, je pro danou variantu např. 1 : 83, což by nebylo příliš přesvědčivé, a proto se používá obvykle 13 markerů, které se vyhodnocují zvlášť a vzájemný pozitivní výsledek důvěryhodnost testu mnohonásobně zvyšuje. První použití DNA v kriminalistice se datuje do roku 1986 a došlo k němu v rámci soudního řízení v Anglii. Testování STR oblastí se však dnes prosazuje i v určování otcovství.
Genetická manipulace
V současnosti je lidstvo schopné provádět cílené změny v genetické informaci (v pořadí nukleotidů v DNA) a ovlivňovat tím některé vlastnosti organismů. Tyto tzv. +more genetické modifikace způsobily revoluci v celé řadě biotechnologických odvětví a umožňují např. průmyslovou produkci hormonů, srážecích faktorů pro hemofiliky, enzymů užívaných v potravinářství a některých vakcín. Výsledkem genetického inženýrství jsou i různé transgenní plodiny, např. ty odolné k herbicidům. V Evropské unii je z geneticky modifikovaných plodin povolena pouze Bt kukuřice, která nese gen cry pocházející z půdní bakterie Bacillus thuringiensis. Tento gen způsobuje, že je rostlina pro své hmyzí škůdce jedovatá.
Biologická systematika
V neposlední řadě se studium sekvencí DNA uplatňuje v třídění organismů podle jejich příbuznosti, tedy v oboru biologie známém jako fylogenetika. Jedním z prvních krůčků v tomto oboru byla v 60. +more letech studie, která srovnávala sekvenci genu pro cytochrom c u různých organismů: výsledky jsou v podstatě intuitivní, zatímco šimpanz má sekvenci tohoto genu s člověkem zcela shodnou a makak rhesus se liší pouze jedinou nukleotidovou záměnou, psí gen pro cytochrom už se od lidského genu liší na 13 místech a kvasinkový gen dokonce na 56 pozicích. Na základě těchto informací si lze udělat obrázek o příbuzenských vztazích mezi organismy. V souvislosti s rozmachem sekvenování je dnes k dispozici obrovské množství sekvencí DNA celé řady organismů a k jejich analýze se používají různé sofistikované nástroje, jako například metoda parsimonie nebo metoda maximální pravděpodobnosti. Dnes je možno i odhadnout čas, který dělí v evoluční historii libovolné dva druhy - metoda k tomu užívaná opět pracuje se sekvencemi DNA a označuje se jako molekulární hodiny. Pomocí fylogenetických přístupů je možno odpovídat na celou řadu dalších otázek, namátkou „jaký vztah mají neandertálci k dnešním lidem“, „jak se mezi jednotlivými nemocnými šíří virus HIV“ a podobně.
Pravěká DNA
Od 50. a 60. +more let 20. století se objevují studie o údajném izolování sekvencí DNA pravěkých organismů. V 80. a 90. letech přinesl tomuto oboru („paleogenetika“) slávu Crichtonův román a jeho Spielbergova filmová adaptace Jurský park (1993), ve kterém byli naklonováni druhohorní (nejen ti z jury) dinosauři. Dinosauří proteiny a měkké tkáně byly skutečně získány např. Mary H. Schweitzerovou a jejím týmem, pravěká DNA dinosaurů ale nejspíš nikdy získána nebude. Nepotvrdily se ani domněnky o získání DNA ze 120-135 milionů let starého libanonského jantaru entomologem Georgem Poinarem v roce 1993. Lze ovšem získat DNA starou více než 1 milión let.
Některé paleontologické objevy nicméně naznačují, že alespoň stopy po původní DNA mohou být v dinosauřích fosiliích z období druhohor skutečně objeveny.
U malého opeřeného dinosaura rodu Caudipteryx, žijícího na území Číny před 125 miliony let (období rané křídy), byla v roce 2021 identifikována fosilie původní buněčné struktury, která by mohla být chromatinem (obsahovat jakési pozůstatky komplexu DNA a bílkovin).
Odkazy
Poznámky
Reference
Literatura
;Česky * * * *
Anglicky
Externí odkazy
[url=http://tech. ihned. +morecz/hnfuture/c1-60455950-dna-nahrazuje-pevne-disky-i-procesory]DNA nahrazuje pevné disky i procesory - současné technické možnosti využití DNA[/url] pozn. Celý článek je k dispozici za poplatek * [url=http://www. fidelitysystems. com/Unlinked_DNA. html]Fidelitysystems. com - fotografie DNA pod elektronovým mikroskopem[/url] * [url=http://www. dnalc. org]DNA Learning Center - internetová stránka zaměřená na popularizaci a výuku informací o DNA a souvisejících tématech[/url] * [url=http://www. ncbi. nlm. nih. gov/guide/dna-rna]DNA & RNA na portálu amerického NCBI - seznam vědeckých databází a informačních zdrojů[/url] * [url=http://www. dnaftb. org]DNA from the Beginning - přehledný popis 75 objevů, které změnily pohled na genetiku a na DNA[/url] * [url=https://www. genome. gov/dna-day/get-activity-ideas]National DNA Day - výukové materiály, různé učebnice a články na téma DNA[/url] * [url=http://www. rcsb. org/pdb/101/motm. do. momID=23]DNA - Molecule of the Month - přehledný článek o struktuře DNA[/url].