Cesko.wiki Western blot
Author
Albert FloresVýsledek imunoblotu (western blotu) z extraktu prvoka rodu Leishmania, zvýrazněno barvivem citlivým na infračervené světlo. Vpravo je označení molekulové hmotnosti hledaných proteinů v kilodaltonech. Western blot (v české literatuře též označovaný jako imunoblot) je analytická technika používaná k detekci specifického proteinu ve směsi s dalšími proteiny, např. ve vzorku homogenátu tkáně či jiného biologického vzorku. Využívá gelovou elektroforézu k separaci proteinů podle jejich velikosti (denaturující SDS-PAGE), popř. podle jejich celkové trojrozměrné struktury (nativní elektroforéza). Následně jsou proteiny přeneseny („přeblotovány“) z gelu na povrch membrány (nejčastěji nitrocelulosové či PVDF), na jejímž povrchu jsou detekovány specifickými protilátkami.
Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale zato přesnější (větší specifičnost).
Metoda dostala své jméno Western blot jako slovní hříčka na podobnou metodu Southern blot používanou k detekci DNA a vyvinutou dříve Edwinem Southernem.
Metodika Western blotu
SDS-PAGE
První část se skládá z klasické SDS-PAGE elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli podle své molekulové hmotnosti. Jednotlivé proteiny vytváří v gelu tzv. +more zóny (v laboratorním slangu tzv. bandy, z angl. proužky).
Přenos
Zařízení určené k "mokrému" přenosu při western blotu. +more Gel z elektroforézy se následně přiloží na PVDF či nitrocelulosovou membránu a pomocí blotovacího zařízení dojde působením elektrického proudu k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. Přístroj je realizován jako soustava anody (spodní díl) a katody (horní díl). Záporně nabité proteiny (obalené SDS) jsou elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů, tj. na povrch membrány).
Blokování
Povrch membrány je nutné tzv. zablokovat, neboť povrch membrány váže proteiny, tj. +more jak antigen, tak i následně přidané protilátky. Blokování těchto nespecifických míst se nejčastěji provádí umístěním membrány do zředěného roztoku nějakého levného proteinu - např. 3 - 5 % BSA či netučné suché mléko v TBS, s přídavkem slabého detergentu jako je Tween 20 (0,05%). Proteiny BSA či mléčného kaseinu z roztoku se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny při přenosu. Po přidání protilátky se už molekuly imunoglobulinů nemohou nespecificky navázat na prázdný povrch membrány, ale musí specificky „hledat“ svůj epitop na přeblotovaných antigenech. Blokování výrazně snižuje šum pozadí a odstraňuje falešné pozitivity.
Detekce
Pro zviditelnění daného proteinu je nutné použití specifické protilátky proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce, buď dvoukrokový (kombinace primární protilátky a sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem) či jednokrokový (s reportérovým enzymem je konjugována přímo primární protilátka).
* Dvoukroková detekce: Po blokování je membrána přenesena do zředěného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5 - 5 μg/ml) v pufrovaném roztoku (např. TBS či PBS) BSA či mléčného kaseinu. +more Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod. až přes noc, za laboratorní teploty či při 4 °C.
Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem detergentu (např. PBS+ 0,05% Tween 20) je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky - komerčně dodávané protilátky proti celé škále primárních protilátek, nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím proteinům (což jsou skoro vždy primární protilátky). +more Tyto sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou konjugovány s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci - např. křenovou peroxidasou (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či alkalickou fosfatázou (AP, z angl. alcalic phosphatase).
* Jednokroková detekce: Při jednokrokové detekci je reportérovým enzymem značena přímo primární protilátka - většinou se tedy jedná o komerčně dodávané primární protilátky proti často používaným proteinům či tagům, např. proti proteinu GFP, či FLAG-tagu, hemaglutininovému (HA) tagu, His-tagu apod.
Vyvolání
kolorimetrický způsob: využívá reakce reportérového enzymu (např. peroxidázy) s chromogenním substrátem. +more Enzym přeměňuje rozpustný (a bezbarvý) substrát na nerozpustný a barevný (např. modrý) produkt. Množství proteinu je poté semikvantitativně stanoveno densitometrií („jak moc barevná je daná skvrna“).
* chemiluminiscenční způsob: reportérový enzym (peroxidáza) přeměňuje chemilumiscenční substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzářením kvanta světla. Množství světla je poté úměrné množství peroxidázy, které je přímo úměrné množství daného proteinů. +more Uvolňované světlo je pak detekováno buď přiložením světlocitlivého filmu, anebo nověji použitím CCD-kamer. Pro kvantifikaci je opět možné použít densitometrii.
Výhody a nevýhody Western blotu
výhoda: oproti detekci proteinů barvením gelu stříbrem je možné poměrně jednoduše, rychle a jednoznačně detekovat jeden protein i ve složité směsi proteinů * nevýhoda: nutnost mít primární protilátku proti danému proteinu, jinak je Western blot neproveditelný
Využití Western blotu
testy na HIV pozitivitu využívají Western blotu pro zjištění přítomnosti protilátek proti viru HIV v lidském séru (sérum testovaného pacienta je použito jako „primární protilátka“) * pro definitivní test na bovinní spongiformní encefalopatii (BSE) * pro konfirmační test na hepatitidu B * jako velice užitečná laboratorní metoda v molekulární biologii, biochemii, imunologii a příbuzných oborech
Použitá literatura
Ferenčík M. , Škárka B. +more, a kol. Biochemické laboratórne metódy. Vydavateľstvo technickej a ekonomickej literatúry, Bratislava, 1984. * Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Elsevier, Amsterdam, 1985. * Tizard I. R. Veterinary Immunology - an introduction. Saunders co. , Philadelphia, 1996. * Toman M. a kol. Veterinární imunologie. Grada Publishing, Praha, 2000.